第3章 发酵工业培养基设计

发布于:2021-09-13 05:30:05

发酵工程
第3章 发酵工业培养基设计
北京科技大学 化学与生物工程学院
生物科学与工程系

适应于大规模工业微生物发酵的培养基的共性:
①单位培养基能够产生最大量的目的产物; ②能够使目的产物的合成速率最大; ③能够使副产物合成的量少; ④所采用的培养基应该质量稳定、价格低廉、
易于长期获得; ⑤所采用的培养基尽量不影响工业好气发酵中
的通气搅拌性能以及发酵产物的后处理等。

3.1 发酵工业培养基的基本要求
设计适宜于工业大规模发酵的培养基应遵循以下原则:
① 必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 ② 有利于减少培养基原料的单耗,即提高单位营养物质的转化率。 ③ 有利于提高产物的浓度,以提高单位容积发酵罐的生产能力。 ④ 有利于提高产物的合成速度,缩短发酵周期。 ⑤ 尽量减少副产物的形成,便于产物的分离纯化,并尽可能减少
“三废”物质的产生。 ⑥ 原料价格低廉,质量稳定,取材容易。 ⑦ 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响,利于提高
氧的利用率,降低能耗。

3.2发酵工业培养基的成分及来源

微生物细胞的化学成分

微生物及 细菌 酵母菌 霉菌 微生物及 细菌 酵母菌 霉菌

组成成分 %

%

% 组成成分 %

%

%

水分 75~85 70~80 85~90 核酸 10~20 6~8 1~5

蛋白质 50~80 32~75 14~20 脂类 5~20 2~15 4~40

碳水化合物 12~28 27~63 7~40 无机盐 2~30 4~7 6~12

微生物细胞含80%左右的水分和20%左右的干物质。在 其干物质中,碳元素约占50%,氮元素约占5~13%,矿物 质元素约占3~10%。

3.2发酵工业培养基的成分及来源
3.2.1 碳源(carbon source)
提供微生物菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌 体所需的碳骨架;提供菌体合成目的产物的原料。
糖类、油脂、有机酸和低碳醇等。碳源贫乏时, 可利用蛋白质水解物或氨基酸等作为碳源。
CO2…

3.2发酵工业培养基的成分及来源
葡萄糖(glucose)
最容易利用的碳源之一,几乎所有微生物都 能利用葡萄糖。是一种速效碳源,但过多的葡萄 糖会过分加速菌体的呼吸,以致培养基中的溶解 氧不能满足需要,使一些中间代谢物(如丙酮酸、 乳酸、乙酸等)不能完全氧化而积累在菌体或培 养基中,导致pH下降,影响某些酶的活性,从而 抑制微生物的生长和产物的合成。

3.2发酵工业培养基的成分及来源
淀粉(starch)
一般经过菌体产生的胞外酶水解成单糖后被 吸收利用。
也可以经过淀粉酶和糖化酶的液化和糖化作 用,变成葡萄糖之后再用于发酵的碳源。

玉米

玉米淀粉
玉米浆

淀粉水解糖

结晶葡萄糖

3.2发酵工业培养基的成分及来源
纤维素(cellulose)
一般先水解成葡萄糖再被微生物利用。是今 后工业生物技术的发展趋势。

Energy Crops: Miscanthus
1 years growth without replanting!

20 tons/acre? (www.bical.net) 10-30 tons/acre (www.aces.uiuc.edu/DSI/MASGC.pdf)

3.2发酵工业培养基的成分及来源
糖蜜(molasses)
是制糖生产时的结晶母液,是制糖工业的副 产物。主要成分是蔗糖
含有丰富的糖、氮类化合物、无机盐和维生 素等,是物美价廉的碳源。
多用于酵母发酵、抗生素生产过程中的碳源。

3.2发酵工业培养基的成分及来源
油和脂肪(lipid)
菌种需要有较高的脂肪酶活性
在许多抗生素的发酵培养基中需要加入油脂,头孢菌 素C,头霉素,红霉素,…
(2012年健康元地沟油事件)

3.2发酵工业培养基的成分及来源
有机酸(organic acids)
乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等 有机酸盐的使用,往往会使发酵液pH上升
重组大肠杆菌培养基中加入柠檬酸、苹果酸等TCA循环 羧酸作为碳源,可以减少“葡萄糖效应”。
http://dict.youdao.com/wiki/%e5%91%bc%e5%90%b8%e4%bb%a3%e8%b0%a2/#

3.2发酵工业培养基的成分及来源
烃和醇类(hydrocarbon & alcohols)
石油副产品作为碳源进行单细胞蛋白生产 例:毕赤酵母(Pichia)以甲醇为碳源进行生长。

3.2发酵工业培养基的成分及来源
发酵行业的废水(waste water)
用某些酵母发酵生产单细胞蛋白 或用于制造生物柴油的油脂。
同时,废水BOD、COD指标下降。 BOD(Biochemical Oxygen Demand) COD(Chemical Oxygen Demand)
http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/Bilder/de/Newsfotos/hefe-yarrowia-lipo,property=bild,bereich=bio,sprache=de.jpg

3.2发酵工业培养基的成分及来源
3.2.2 氮源(nitrogen source)
有机氮源 蛋白胨、酵母粉、玉米浆、黄豆饼粉、鱼粉…
被微生物分泌的蛋白酶作用下,水解成氨基酸并进而吸收利用。 除蛋白质、多肽和游离氨基酸外,往往还含有少量糖类、脂肪、
无机盐、维生素和某些生长因子。 尿素也是一种有机氮源。

玉米浆(corn steep liquor)
? 玉米淀粉生产中的副产物,是一种容易被微生物利用 的良好氮源。廉价、pH~4.0
? 氮源中的某些氨基酸是合成β-内酰胺类抗生素的前体。
有机氮源的使用:注意生产厂家及生产批号!

http://www.hmshah.com/chemicals.html

http://www.hebanshanshengwu.cn/athena/offerdetail/sale/hebanshanshengwu-1605-846479340.html
~3000 元/吨

无机氮源
? 铵盐、硝酸盐、氨水等 ? 氨水除了常作为pH调节剂,也是一种容易被利用的
氮源。
? 微生物对无机氮源的吸收利用一般较快,也称为速效 氮源。但常引起发酵液pH的变化。

3.2发酵工业培养基的成分及来源
3.2.3 无机盐及微量元素
磷、镁、硫、钾、钠、铁、氯、锰、锌、钴等
作为微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的 调节物。
一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作 用,在高浓度时常表现出抑制作用。
磷、镁、硫、钾、钠、氯等多以盐(如硫酸镁、磷 酸二氢钾、氯化钾、碳酸钙等)的形式加入,而铁、锰、 锌、钴等因其需要量小,在复合培养基中往往已含有, 很多时候并不需要单独加入。

? 磷 → 核酸和蛋白质 ? 镁 → 许多重要酶(己糖磷酸化酶、柠檬酸
脱氢酶、羧化酶等)的激活剂
? 硫 → 蛋白质、β-内酰胺抗生素 ? 铁 → 细胞色素、过氧化氢酶等 ? 钴 → 维生素B12 某些酶的辅基

3.2发酵工业培养基的成分及来源
3.2.4 水 洁净、恒定的水源 矿物质影响发酵(正or负影响) 酿酒工业
青霉素生产
碳钢发酵罐→铁离子对青霉素生产不利(<30μg/ml)→表面树脂处理or不锈钢发酵罐

3.2发酵工业培养基的成分及来源
3.2.5 生长条件物质
生长因子
凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质,如氨基酸、 嘌呤、维生素…
前体(precursor)
青霉素生产 玉米浆中苯乙胺可作为前体合成青霉素,加苯乙酸…
产物合成促进剂
表面活性剂、酶的诱导物…

3.3 微生物的培养基类型
3.3 培养基类型
3.3.1 斜面培养基
供微生物生长繁殖或保藏菌种用,富含有机氮源。
3.3.2 种子培养基
短时间内获得数量多、质量高的大量菌种,以满足发酵生 产的需要。须含有较完全和丰富的营养物质,特别是充足的氮 源和必需的生长因子。由于培养时间短,且不要求积累产物, 各种营养物质的浓度不需要太高。可添加一些容易被吸收利用 的碳源和氮源,如葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、蛋白胨等。 为缩短发酵阶段延迟期,其主要成分应和发酵培养基接*。
3.3.3 发酵培养基
是发酵生产中最主要的培养基,是为了最大限度获得目的 产物。应根据菌体自身生长规律、产物合成的特点来设计。

3.4 发酵培养基的设计原理与优化方法
3.4.1 发酵培养基的设计原理
首先确定培养基的组成成分,然后确定各组 分之间的最佳配比。
目前无法完全从生化反应的基本原理来推断 和计算出某一菌种的培养基配方,只能用生物化 学、细胞生物学、微生物学等学科的基本原理, 参照文献报道的某一类菌种的经验配方,再结合 所用菌种和产品的特性,采用摇瓶及小型发酵设 备,按照一定的实验设计和实验方法选择出较为 适合的培养基。

作出细胞生长和产物形成的化学计算的*衡:
碳源和能源 + 氮源 + 其他需要 → 细胞 + 产物 + CO2 + H2O + 热量
组成微生物的元素包括C、H、O、N、S、P、Mg和K(见下表),这些 元素都要在方程式中予以*衡。
在培养基中有些元素的含量往往超过需要量,如P和K。而其它元素含量则接*最低值 (如Zn,Cu等)。在许多培养基中增加磷酸盐浓度,其用意是增加培养基的缓冲容量, 这一点,在设计培养基时要引起注意。

有些微生物无力合成的特定营养物,如氨基酸、维生素或核苷 酸。一旦测出其中一种是生长因子,就要在培养基中加入适量的 纯净的化合物或含有该物质的混合物。
碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用,在需氧条件下 ,对碳源的需要量可以从菌体对底物的产率系数(Yx/s)推算而得。
Yx/s的定义是:细胞干物质的产量/碳源底物的被利用量 下表中列出了一些Yx/s值。如以葡萄糖为底物时,其Y值为0.5 即表示每1g葡萄糖能生成0.5g细胞干物质。为要获得30 g L-1浓度 的细胞,需要葡萄糖30/0.5=60 g L-1。

示例:
Wolfgang Minas, 2011. Institute of Biotechnology, ETH Zürich

3.4 发酵培养基的设计原理与优化方法
需要考虑的因素: (1)菌体的同化能力
大分子or小分子底物? 淀粉or葡萄糖,蛋白质or氨基酸?
(2)培养基对菌体代谢的阻遏和诱导
葡萄糖效应 无机氮源对蛋白酶产生的阻遏

3.4 发酵培养基的设计原理与优化方法
(3)碳氮比对菌体代谢调节的重要性
氮源多,菌体生长旺盛,pH偏高,不利于代谢产物积累; 碳源多,易形成较低pH;碳源不足,菌体易衰老和自溶。 不同生长阶段对碳氮比的最适要求不一样。 一般工业发酵培养基的碳氮比为100:(0.2~2),需根据 产物含氮量调整。
(4)pH对不同菌体代谢的影响
可用酸碱调节发酵液pH 合理配制培养基可使整个发酵过程中pH处于较为适宜状态。 可流加底物调节pH。

3.4 发酵培养基的设计原理与优化方法
3.4.2 发酵培养基的优化方法
①根据以前的经验以及在培养基成分确定时必须考 虑的一些问题,初步确定可能的培养基成分;
②通过单因子优化实验确定最为适宜的各个培养基 组分及其最适浓度;
③最后通过多因子实验,进一步优化培养基的各种 成分及其最适浓度。

3.4 发酵培养基的设计原理与优化方法

虾青素产量 (μg/L) 虾青素干细胞含量 (μg/g) 生物量(g/L)

单因素的优化
氮源优化 6000

碳源优化

1000

12

800

600

8

400

4

200

0

0

20

25

30

35

40

碳量(g/L)

生物量 虾青素干细胞含量

4000

2000

0 蛋白胨

酵母粉

硫酸铵 氮源种类

氯化铵

牛肉膏

3.4 发酵培养基的设计原理与优化方法
3.4.2 发酵培养基的优化方法
正交实验设计 响应面分析方法 遗传算法设计 ……

思考题
? 为什么需要进行微生物培养基的优化? ? 除了微生物培养基的各种组成成分,你认为培养
基的优化过程中还需要考虑哪些关键的因素? ? 如果让你优化某一微生物菌种的培养基,你会怎
么去做?
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